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前已述及，底物水平磷酸化实际上就是先合成一些含高能键的化合物，如1,3-二磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或琥珀酰辅酶A等，在特定酶的催化下，这些高能化合物再把能量转移给ADP，让ADP被磷酸化成ATP。氧化磷酸化则是一种与呼吸链上的电子传递相偶联，使ADP磷酸化生成ATP的方式。在生物氧化过程中，从代谢物脱下来的高能电子需要经过一系列中间传递体（呼吸链），最后传给末端电子受体氧气，其间能量逐步释放，那么，电子在呼吸链上传递时释放的能量是如何转移到ATP中的呢？ 氧化磷酸化的机制十分复杂，对这一机制的揭示就产生了两次诺贝尔奖，可以说是人类顶级大脑的强强联合。关于氧化磷酸化的机制，科学家最早提出了各种假说，因为缺乏证据都难以立足。1961年，英国化学家Peter Mitchell受电池工作原理的启发，提出了一种全新的观点---化学渗透学说。他认为电子在沿着呼吸链依次传递的时候，释放的自由能先转化为跨线粒体内膜的质子梯度---电化学势能，即在电子传递过程中，质子从线粒体基质被泵到内外膜间隙，形成跨线粒体内膜的质子梯度，质子梯度中蕴藏的电化学势能驱动了ATP的合成。 这一学说提出后遭到了强烈的反对和抨击，以至于Peter Mitchell不得不离开原来的实验室回家自建实验室找证据。 支持化学渗透学说的关键证据是什么呢？其实，就是要证明两件事情：①呼吸链在传递电子时产生了质子梯度；②质子梯度驱动了ATP的合成。 科学家将离体线粒体悬浮于不含氧气的培养液中，密封后外接pH电极，测定溶液中的氢离子浓度变化情况，一段时间后再通入氧气，结果如图所示。 
该实验证明呼吸链在传递电子的时候确实产生了质子梯度。这个质子梯度能否驱动ATP的合成？科学家通过建立人工质子梯度，模拟线粒体内膜两侧的质子动力势，巧妙的检验了这一假说。嗜盐古菌的细胞膜上有一种菌紫红质，它可以直接捕获可见光的能量，利用光能将质子从细胞内泵到细胞外，形成跨膜质子梯度，是一种光驱动泵。科学家将菌紫红质、ATP合酶加到人工脂质体上，光照处理后发现有ATP合成。 
另一个实验也能证明这个问题。向离体的线粒体溶液中突然加酸，制造内膜两侧的质子梯度，检测到有ATP的合成。 
以上两个人工质子梯度经典实验证明，质子梯度确实驱动了ATP的合成。 一些反面的实验也提供了有力的证据。 实验发现ATP的合成依赖完整的线粒体内膜，当线粒体内膜破裂后，质子梯度瞬间被破坏，ATP无法合成。一些解偶联剂通过消耗质子梯度，使质子流发生短路，解除了电子传递与氧化磷酸的偶联关系，抑制了ATP的合成。 以上实验证据从多个角度支持了化学渗透学说，米切尔因其在生物能量学领域的开创性贡献于1978年获得诺贝尔化学奖。 化学渗透假说在当时是一个极具争议的理论，因为它颠覆了学界对生物能量转换的传统理解，一经提出便遭遇了一众大咖的抨击。然而，随着时间的推移，这一理论得到了广泛的实验验证，并成为现代生物化学和细胞生物学的核心内容之一。该学说解释了细胞如何高效地将化学能转化为生物可利用的能量形式ATP，为理解细胞呼吸、光合作用等生理过程的能量转换机制提供了关键的理论基础，这一开创性理论是现代生物化学和细胞生物学的重要里程碑。
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