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单克隆抗体是指从单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原的抗体。单克隆抗体与普通血清抗体相比较，具有特异性强和灵敏度高的特点，在医学和科研中具有很高的应用价值，单克隆抗体的制备和应用也是高考经常考查的热点问题。单克隆抗体的制备过程中，除了运用动物细胞融合技术，还运用了动物细胞培养、杂交瘤细胞筛选等操作，笔者对单克隆抗体制备中常见的一些疑难点加以辨析，为教学备考提供参考。 1、制备单克隆抗体用的是 B淋巴细胞还是浆细胞 哺乳动物B淋巴细胞的发育过程：祖 B细胞→前B细胞→未成熟B细胞→成熟B细胞→活化B细胞→浆细胞。B细胞在骨髓等中枢免疫器官中发育到成熟B细胞，再迁移到脾脏和淋巴结等外周免疫器官中。在外周免疫器官中,成熟B细胞接受抗原刺激，在抗原呈递细胞、辅助性T细胞协助及细胞因子的作用下，发育为活化B细胞后才具有分泌抗体能力，活化B细胞可以继续增殖分化，最终发育为浆细胞。成熟B细胞仅有结合在膜上的膜型抗体作为抗原受体，不分泌抗体；浆细胞是B巴细胞的终末特化细胞，分泌抗体能力非常强大每秒可以分泌1000~2000个体，寿命通常只有3~5天。过强的抗体分泌能力可能不利于杂交瘤细胞的存活，且浆细胞与骨髓瘤细胞的融合效率低。有研究证实,再次免疫时小鼠注射抗原后7~8天抗体达到最高峰，即此时脾脏中浆细胞数量达到高峰，但是取此时的脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合的效率很低。实验证实取免疫后3天的脾细胞进行细胞融合的效率最高，此时大多数B细胞正处于活化B细胞时期，因而用于融合的细胞主要是取自脾脏的活化 B细胞。 2、每个B淋巴细胞只产生一种特异性抗体的原因 人教版高中生物学教材选择性必修3《动物细胞融合与单克隆抗体》一节中提到“动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞,形成细胞群”。学生对教材这段话的理解需要借助以下拓展知识。 B细胞的发育过程中,编码 Ig(抗体)基因的胚系基因片段会发生重排和组合。这一过程主要通过 V(D)J重组[也称为 V(D)重排]来实现。抗体结合抗原的可变区基因由可变区(V)、多样性区(D，仅重链有）、连接区(J)各一个基因片段组成，V(D)重组发生在B细胞发育的早期阶段，V、D了区均有多种不同的拷贝片段，在B淋巴细胞发育过程中，在重组酶的作用下不同的 V、D(仅重链)了基因片段会被随机选择一个片段并连接在一起这种选择性排列会导致多样的V、D和J基因片段的组合。在连接过程中，细胞还会增加、删除或替换某些核苷酸(核苷酸添加)，这一步骤进一步增加了抗体多样性的潜力。此外抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，重链和轻链都会发生随机重排，两者再结合成抗体，这又进一步增加了抗体的多样性。二倍体细胞中两条染色体的重链和轻链抗体基因只有一条随机发生重排和表达，另条不表达，表达的轻、重链再结合形成抗体，这使得每个B淋巴细胞最终产生的抗体只有一种。抗体重排成功后的成熟B细胞，产生的抗体会结合在B细胞膜上，即抗原受体，但不会产生分泌型抗体在成熟B细胞发育到浆细胞的后期阶段，抗体基因还会经历体细胞高频突变，这一过程在重链的可变区尤为显著，通过引入随机突变来进一步增加抗体的多样性。这些突变可能影响抗体对抗原的亲和力和特异性，从而优化B细胞对抗原的识别能力。 B淋巴细胞经过复杂的基因重排和轻、重链随机结合后，具有高度多样性，再加上核苷酸添加和体细胞高频突变，理论上可产生的抗体种类可高达1012种，因而每种B淋巴细胞产生的抗体都不相同，B淋巴细胞发育到成熟B细胞阶段后，基因已经重排和选择完毕，但活化B细胞的增殖过程中还会发生体细胞高频突变，该突变只发生在可变区，产生的抗原受体需经历抗原选择作用，与抗原结合力高的B细胞才能避免凋亡，存活下来并继续增殖和突变，从而保持了抗原受体与抗原结合的特异性。活化B细胞和浆细胞可以将抗体受体分泌到细胞外即分泌型抗体，一般所说的抗体即分泌型抗体。 在单克隆抗体制备过程中，活化B细胞在体外不会发生高频突变，同一活化B细胞增殖产生的克隆细胞群产生的抗体是相同的。因此，只需克隆单一的B淋巴细胞,就可以获得大量的单一抗体,即单克隆抗体。 3、用同一抗原处理小鼠可以产生3多种抗体的机制 如上所述，免疫系统通过基因重排等机制，可产生的抗体具有非常高的多样性，每个成熟 B细胞的抗原受体(即膜型抗体)各不相同，某抗原入侵时，免疫系统通过一定机制将含有能与该抗原结合的膜型抗体的B淋巴细胞选择出来，并大量增殖分化成活化B细胞和浆细胞，分泌大量特异性识别该抗原的抗体。 每种生物都含有特有的蛋白质，在自然选择和进化中，蛋白质成为特异性免疫系统识别的主要抗原物质。蛋白质分子量通常都较大，其表面结构中通常含有多种不同的能被抗体结合的抗原表位(或称抗原决定簇)。用同一蛋白质抗原处理小鼠，小鼠体内可能有多种B淋巴细胞可以与不同的抗原表位结合，从而被免疫系统选择并增殖，产生不同的抗体,因而血清中含有多种针对该抗原的抗体这种血清抗体称为多抗。多抗的抗体种类较多，纯度低,因而特异性较差，产量也低。因此制备单克隆抗体过程中要对杂交瘤细胞进行严格多次筛选，保证用于产生抗体的杂交瘤细胞来自同一杂交瘤细胞的克隆。 4、特定的培养基如何将杂交瘤细胞筛选出来 细胞增殖时，DNA复制所需的核苷酸合成有两个途径：从头合成途径和补救合成途径，正常细胞中两个途径都具备。前者由氨基酸和其他小分子化合物从头合成核苷酸，该途径可以被氨基喋呤(A)抑制。补救合成途径需要胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和次黄嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)，还需要次黄嘌呤(H)及胸腺嘧啶核苷(T)作为原料 在基本培养基中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)及胸腺嘧啶核苷(T)，称为 HAT培养基。在HAT培养基中，从头合成途径会被氨基喋呤抑制而用于融合的小鼠骨髓瘤细胞为 TK 或 HGPRT 缺陷株(不能进行补救合成途径)，因而不能在该培养基上增殖；B淋巴细胞在体外环境下不能增殖，段时间后即死亡，只有两者融合的杂交瘤细胞可以通过补救合成途径合成 DNA，又具备骨髓瘤细胞无限增殖的特点，可以在该培养基上大量增殖，而未融合细胞及同种融合的细胞都不能增殖，最终死亡。 5、杂交瘤细胞为何要进行克隆化培养和专一抗体检测 如上所述,将特定抗原注入小鼠引起免疫反应后，小鼠体内能与该抗原识别结合的B淋巴细胞被选择出来并大量增殖。脾脏是B淋巴细胞集中分布的免疫器官，经过多次免疫动员，脾脏中与该抗原识别结合的B淋巴细胞数量大大扩增，达到数十万倍，但是蛋白质抗原通常含多种抗原表位，脾脏中被扩增的B淋巴细胞可能来自多个成熟B淋巴细胞，产生的抗体不同,融合的杂交瘤细胞产生的抗体也就不同，要得到单克隆抗体，需要对杂交瘤细胞进一步筛选，确保来自同一杂交瘤细胞的克隆 筛选时对杂交瘤细胞进行有限稀释，使每毫升培养液中杂交瘤细胞的数量约为5~10个，在多孔细胞培养板的每个孔中滴加 0.1ml培养液，使每个孔的杂交瘤细胞通常不超过一个。经过一段时间的培养和增殖后用抗原检测孔中的培养液，发生抗原一抗体结合反应(阳性反应)的孔中就含有能产生特定抗体的杂交瘤细胞。但一次处理并不能保证孔中初始只有一个杂交瘤细胞，因而需要将发生阳性反应的孔中增殖的细胞再进行有限稀释，重复上述操作3~5次，才可保证得到的细胞克隆自同杂交瘤细胞，产生的抗体只有一种。通过筛选的不同细胞株虽然都能与抗原结合，但因抗原通常含有多个抗原表位，能够被不同的B淋巴细胞的抗原受体识别，故产生阳性反应的孔中可能是来自不同活化B淋巴细胞融合的杂交瘤细胞，产生的抗体也不一定相同，只有来自同一杂交瘤细胞的克隆株产生的抗体才是完全一致的。 此外,细胞融合得到的杂交瘤细胞并不稳定容易发生染色体丢失，进而丧失分泌抗体能力，因而也需要经过多次筛选得到抗体分泌能力强且稳定的细胞株，且每次传代培养时都需要保存部分原细胞株，以防止培养的杂交瘤细胞丢失抗体分泌能力。
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