限制酶的作用及选择

限制酶的作用

1970年，阿尔伯（W. Arber)、内森斯（D. Nathans)，史密斯（H . C. Smith)在细菌中发现了第一个限制性内切酶（简称限制酶）后，20世纪70年代初相继发现了多种限制酶和连接酶，以及逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。

定义： 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶

来源： 主要从原核生物中分离纯化出来的

作用特点：

（1）能够专一性识别双链DNA分子的特定核苷酸序列；一般由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。

（2）使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，黏性末端和平末端。

（1）黏性末端

     限制酶在它识别序列的中心轴线两侧，将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。

（2）平末端

       限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。

限制酶选择原则

  1.有其识别序列，且两方能得到相同末端(相同酶或同尾酶)

  2.质粒上该切点应该位于启动子下游、终止子上游

  3.不破坏目的基因

  4.不破坏质粒完整性（即不能同时有一种限制酶的多个切点）

  5.不破坏质粒上的关键因子

  6.尽量双酶切（避免自我成环和反向连接）(但要确保质粒上也有这两种酶或同尾酶的切割位点)。

  7.避免无效切割（切割点内含另一种酶的切割点）

  8.双酶切点间尽量靠近，不丢失重要序列

  9.农杆菌转化法中，酶切点应该位于T-DNA内

选择技巧

根据甲乙两图信息选择合适的限制酶：

思考：能否Sma Ⅰ选择限制酶，为什么？

能否只用选择限制酶PstⅠ，为什么？

能否只用选择限制酶EcoRI，为什么？

(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类

①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，且在质粒上也存在该切点或同尾酶切点。如图甲可选择Pst。

②不能破坏目的基因（切割位点不能位于目的基因内部），如图甲不能选择Sma Ⅰ。

③尽量使用双酶切（为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接）(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。

④避免无效切割（切割点内含另一种酶的切割点）

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类

①质粒上该切点应该位于启动子下游、终止子上游

②不破坏质粒完整性（即不能同时有一种限制酶的多个切点）

③不破坏质粒上的关键因子

④双酶切点间尽量靠近，不丢失重要序列