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Cold-PCR（冷聚合酶链反应）是一种基因分析技术，旨在通过选择性降低野生型等位基因的扩增效率，从而增强带有突变基因的扩增信号，提高低频突变的检测灵敏度。其基本原理主要基于碱基配对的热力学属性和DNA双链的解链温度（Tm）变化。 Cold-PCR原理详解 1. 碱基错配与解链温度变化： • 在DNA双链合成过程中，单个核苷酸的错配会导致该段序列的解链温度（Tm）产生微小的但可预测的变化。这种变化取决于错配的位置以及上下游碱基的背景。 2. 临界变性温度（Tc）的设定： • 每条DNA序列都有一个低于其Tm的临界变性温度（Tc），当温度低于Tc时，PCR的扩增效率会急剧下降。 • 在Cold-PCR中，通过设定一个低于野生型DNA双链Tm但高于突变型DNA双链（异源双链）Tm的变性温度Tc，可以实现对突变型基因的选择性扩增。 3. PCR反应过程： • 第一步：样本DNA被加热至解链温度以上，使双链DNA完全解开形成单链DNA。 • 第二步：将反应温度降低至Tc以下，此时野生型等位基因由于完全配对而重新结合成双链DNA，而突变型等位基因由于与野生型存在错配，其Tm值较低，因此继续保持为单链DNA状态。 • 第三步：采用正常的PCR扩增条件对DNA进行扩增。由于野生型等位基因为双链DNA，其扩增效率较高；而突变型等位基因由于仍然为单链DNA，其扩增效率较低。然而，在Tc温度下，异源双链（突变型与野生型形成的双链）会优先变性，从而与引物结合并被扩增，而同源双链（野生型与野生型形成的双链）则保持双链状态，扩增效率受到抑制。 4. 扩增产物检测： • 经过若干循环后，突变型等位基因的扩增产物会逐渐积累，而野生型等位基因的扩增产物则相对较少。 • 最后，利用各种分析方法（如测序、SNP芯片、高分辨率熔解曲线等）对扩增产物进行检测，从而实现低频突变的灵敏检测。 
Cold-PCR的主要特点 • 高灵敏度：能够检测到低至0.1%~1%的突变含量，适用于肿瘤早期阶段或治疗后微量肿瘤突变基因的检测。 • 广泛应用：广泛应用于癌症、遗传性疾病的检测，也应用于胎儿遗传病及与突变有关疾病的产前筛查。 • 操作简便：不需要额外的设备和试剂，设计巧妙，操作简便。 Cold-PCR的两种类型 
• 完整Cold-PCR：适用于富集几乎所有的突变。在常规PCR基础上扩增出一定量的目标序列后，再加入一个分子杂交步骤，使突变单链与野生单链间错配形成异源双链。然后调低变性温度优先使异源双链变性并与引物结合进行扩增。 • 快速Cold-PCR：适用于富集Tm较低的突变位点。由于有些突变等位基因的序列Tm值较低，因此不需要额外的杂交步骤即可实现快速扩增。
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