杂交瘤细胞制备单克隆抗体过程中的“二筛二检二克隆”一、一筛--筛选杂交瘤细胞 1.融合后的细胞进行第一次筛选的原因 将绵羊红细胞注人小鼠腹腔，引发小鼠产生体液免疫。从机体最大的免疫器官--脾脏收集包括 B淋巴细胞在内的诸多脾细胞，借助于灭活的仙台病毒或聚乙二醇等促融剂的作用与有代谢缺陷的同种小鼠骨髓瘤细胞随机融合，进而获取杂交瘤细胞。但事实上，最终获取的细胞混合悬液中至少有5类细胞，包括未融合的骨髓瘤细胞、各种脾细胞、融合的脾-脾细胞、瘤-瘤细胞和脾-骨髓瘤细胞。所以要想获取杂交瘤细胞必须先对所有融合后的细胞进行初次筛选。 2.筛选杂交瘤细胞的机理 如何去除其他细胞而保留杂交瘤细胞，科学家在实验开展前就有了筛选考虑，即根据细胞中脱氧核苷酸合成途径设计出 HAT 培育基加以选择，脱氧核苷酸作为 DNA 复制的原料，其在细胞增殖过程中有全合成和补救合成2条生成途径。全合成途径(D途径)是由氨基酸及其他小分子化合物合成脱氧核苷酸，但这一过程可被氨基蝶呤(A)阻断。补救合成途径(S途径)是指在胸苷激酶(TK)和次黄嘌呤磷酸核苷转移酶( HGPRT)的催化下，胸(T)和次黄嘌呤(H)作为原料合成相应的脱氧核苷酸，此过程两种酶缺一不可，HAT 液体培养基是指添加有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸苷(T)的动物细胞完全培养基,其筛选的机理是：未融合的脾细胞和融合的脾-脾细胞因不能增殖而衰老死亡；未融合的代谢缺陷型骨髓瘤细胞和融合的瘤-瘤细胞因缺少 TK 或 HGPRT无法进行 S途径，D途径又被A阻断，也因不能增殖而很快死亡。脾-骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞既有脾细胞的S途径，又有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，因此可被 HAT 培养液筛选出来 3.筛选操作 将完全培养基中的融合细胞离心，弃去上清液后加入 HAT培养基，轻轻打散融合细胞团后转移至多孔细胞培养板(每孔细胞不止一个)，培养 4~5d后可见部分孔的底部出现小细胞团，则此孔中的细胞即为杂交瘤细胞。之后将 HAT 培养基逐步替换为 HTT 培养基和完全培养基，为第二次筛选做准备。 二、一检--初步检验杂交瘤细胞中是否含有目标杂交瘤细胞 1.专一抗体检验的原因 通过 HAT 培养基筛选出来的杂交瘤细胞是术经分离处理的各种脾细胞和瘤细胞形成的杂交细胞混合群，既有可产生抗绵羊红细胞抗体的目标杂交瘤细胞(特定的B细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞)，也有产生其他抗体和不产生抗体的杂交瘤细胞。所以为了进一步筛选出目标杂交瘤细胞必须要先对杂交瘤细胞混合群进行专一抗体检验，依据多孔细胞板中有无阳性反应判断是否含有目标杂交瘤细胞，然后再确定后续工作的必要性。 2.专一抗体检验方法 专一抗体检验的方法，有酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光技术和放射免疫测定等，其中ELISA 间接法应用最为广泛。其基本操作过程： ①形成固相抗原。将特异性抗原吸附在固相载体表面形成固相抗原，洗涤未结合的抗原及杂质。②)加待测样品。待测样品中特异抗体与固相抗原结合形成固相抗原-抗体复合物，洗涤固相载体，只留下特异性抗体。③加酶标抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤未结合物质，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。④加酶反应底物。底物可在酶催化下使其所含的供氢 体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色变化。根据颜色的变化判断有无相应的免疫反应或用光电比色法测定样品中抗体的含量, 依据专一抗体检验的结果若有阳性反应，则选择阳性孔进行下一步操作；若无阳性反应,则无需进行后续操作。 三、一克隆--克隆阳性孔中所有杂交瘤细胞 阳性孔中的杂交瘤细胞除了含有目标杂交瘤细胞，也含有非目标杂交瘤细胞。为了准确地筛选出目标杂交瘤细胞，需要对阳性孔中的杂交瘤细胞进行分离与扩增。 克隆是指单个细胞通过无性繁殖获得一群纯系细胞的培养过程。克隆化的方法包括有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法和单克隆细胞集团显微操作法等。其中最常用的是对细胞伤害较小的有限稀释法，其操作是将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板( 一孔一细胞)上培养。需要明确的是教材中此处“克隆阳性细胞”所指的不是仅克隆阳性孔中的目标杂交瘤细胞，而是克隆阳性孔中的所有杂交瘤细胞。 四、二筛+二检--筛选出目标杂交瘤细胞 其实一检一克隆和二检都属于二筛的范畴，均是为了准确地筛选出目标杂交瘤细胞。取多孔细胞培养板的上清液进行第二次专一抗体检验。由于多孔细胞板的每孔细胞为单克隆细胞，若检验结果呈阳性，则该孔里的细胞即为目标杂交瘤细胞。 五、二克隆--克隆目标杂交瘤细胞 由于克隆化后的阳性孔仅有少量目标杂交瘤细胞，所以在获取目标杂交瘤细胞后还要继续克降化培养得到一定数量的杂交瘤细胞才可用于科研或大规模抗体生产。常见的单抗获取方式是将其注人小鼠腹腔进行体内培养或在培养基中进行体外培养一段时间后从动物腹水或培养基中提纯抗体。 |