【推荐阅读】生长素调控根向重力性在植物激素实验教学中的应用/梁梦晓等

来源：仪征中学　时间：2024-10-24

生长素调控根向重力性在植物激素

实验教学中的应用

梁梦晓覃超门淑珍（南开大学生命科学学院）

刘华彬（安徽科技学院生命与健康科学学院）

摘要

根是植物重要的器官，其向重力生长是由生长素的浓度与分布所调控的，是植物对环境信号作出的生理反应。本文对模式植物拟南芥的根进行改变重力方向的刺激，借助含有响应生长素的分子标记的 DR5rev:GFP、DR5:3xVenus 和 DR5:GUS 转基因株系，可视化在重力方向改变刺激下根尖两侧的生长素不对称分布，同时观察生长素极性运输载体的相关突变体pin2-T、aux1-T 在重力方向改变刺激下的表型，帮助学生深入理解生长素调控拟南芥根向重力生长的生理机制。

关键词

生长素向性生长极性运输拟南芥

根的向重力性作为决定根系空间生长趋势的主要因素之一，能够影响植物对养分的吸收，且向重力生长是一个复杂的生理过程，是植物适应外界环境的重要特征之一。生长素的不对称分布是植物向性生长的主要原因，而其不对称分布依赖于质膜上极性定位的生长素输入载体 auxin resistant 1/like AUX1（AUX1/LAX）和输出载体 pin-formed（PIN）蛋白家族，因此学生在观察根的向重力生长时，可以进一步了解生长素极性运输的特点，深入认识生长素的生理特性。拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种模式植物，是观察和理解根向重力弯曲生长的理想材料。在植物激素实验课程中，缺少生长素调控根向重力性的相关实验，因此本文设计此类实验以帮助学生深入理解生长素调控植物根向重力性的生理机制。

1 实验原理

生长素作为最早被发现的植物激素，通过促进细胞的伸长和分裂来影响植物不同发育时期组织和器官的分化与生长，同时通过极性运输调控植物的向性生长。植物根的向重力性是指在重力的作用下，其表现出沿着重力方向生长的特性，包括重力的感知、信号转导、生长素不对称分布和弯曲生长 4 个环节。其中，根冠的柱状细胞是感受重力信号的部位，根尖的伸长区细胞是对重力刺激作出反应的部位。生长素具有极性运输的特性，在植物体内的定向运输由输入载体 AUX1/LAX 蛋白家族、输出载体 PIN 家族和 p-glycoprotein（PGP）家族共同调控。研究表明，根受到重力方向改变的刺激后，生长素在 AUX1、PIN3 和 PIN2 载体介导下，使根尖伸长区近地侧和远地侧细胞的生长素浓度出现差异，进而导致伸长区两侧细胞的生长速率不同，造成根尖向新的重力方向弯曲生长。拟南芥在重力方向改变的刺激下，根尖向新的重力方向弯曲，且随着时间的推移，弯曲的角度愈加明显，学生可以通过观察重力方向改变刺激下不同时间节点的拟南芥幼苗根尖弯曲的角度，理解根向重力生长的现象。

生长素在植物营养生长和生殖生长过程中均发挥着重要作用，其在植物组织的不均匀分布，会引起植物体不同的生长变化，故而理解生长素在组织和细胞间的分布对于阐明生长素调控拟南芥根向重力生长的生理机制至关重要。生长素报告基因 DR5 由 7 个生长素应答元件组成，这些元件是生长素应答转录因子（auxin response factors，ARF）的结合位点。在 DR5 控制下表达适当的荧光蛋白，能够可视化生长素在植物组织中的积累与分布。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在紫外线照射下能够被激发，发出绿色荧光，因此可以通过 DR5rev：GFP 来指示拟南芥体内生长素的响应水平和变化趋势。带有核定位序列的DR5：3xVenus 也可以清晰地反映植物体内生长素的响应。此外，β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）被广泛用作报告基因，对 DR5：GUS 转基因拟南芥幼苗进行重力方向改变处理后，通过 GUS 染色，在显微镜下可以观察和比较植物根尖生长素的变化。在重力方向改变刺激下引起的根尖两侧生长素不对称分布主要由生长素运输载体 AUX1 和 PIN2 介导，aux1-T 和 pin2-T 突变体表现出向重力生长异常。学生可以通过比较重力方向改变刺激下野生型和突变体拟南芥幼苗根尖的表型，测量并统计根尖的弯曲角度，进一步理解生长素调控植物根向重力生长的生理机制。

2 教学设计与安排

2.1 教学目的

该实验不仅能够填补植物激素实验教学中“生长素调控根向性生长”部分内容的空白，还能进一步加深学生对生长素极性运输的理解和认识。此外，还可以帮助学生熟悉显微镜的操作和使用。

2.2 教学重点与难点

此实验教学的重点在于帮助学生学习和理解在重力方向改变的刺激下，生长素如何依赖运输载体在根尖形成不对称分布，从而使根尖沿着新的重力方向生长。而教学难点在于利用荧光显微镜观察生长素报告基因 DR5rev：GFP 与 DR5：3xVenus 的表达，以及相关突变体向性实验的观察与测量。

2.3 实验材料与设备

实验材料包括野生型拟南芥哥伦比亚生态型（Columbia-0，Col-0），突变体 aux1-T和 pin2-T，以及 DR5rev：GFP、 DR5：3xVenus 和 DR5：GUS 转基因拟南芥幼苗。

实验仪器包括激光共聚焦显微镜、正置荧光显微镜、体视显微镜、扫描仪、超净工作台、光照培养箱和灭菌锅等。

2.4 教学安排

本实验可以分为 4 个部分进行：1）重力处理 0、12 和 24 h 后分别观察拟南芥幼苗根尖弯曲情况并拍照（4 个学时）。2）在激光共聚焦显微镜下观察重力刺激前、后 DR5rev：GFP 和 DR5：3xVenus 转基因拟南芥根尖的荧光信号（8 个学时）。3）将重力刺激前、后的 DR5：GUS 转基因拟南芥幼苗分别放入含有 GUS 染液的 12 孔板，观察其根尖处 GUS 染色情况（4 个学时）。4）观察拟南芥野生型和突变体在重力刺激下根尖的弯曲情况，并统计根尖的弯曲角度（8 个学时）。

3 实验步骤

3.1 拟南芥幼苗的种植与培养

种植与培养工作由教师提前完成。在超净工作台中分别用 70% 乙醇和 1% 次氯酸钠处理拟南芥种子 5、10 min 进行表面消毒，然后用无菌水清洗 4~5 次后保存于 1.5 mL 离心管中，在 4℃冰箱内放置 2~3 d 后，在超净工作台中将种子整齐播种在 MS 固体培养基上（播种密度不宜过大），培养皿用封口膜密封后垂直放置于培养条件为 16 h 光照/ 8 h 黑暗、光照强度为 100 μmol·m-2 ·s -1 、温度为（22±1）℃的培养箱中。

3.2 实验试剂的配制

1）GUS染色液：0.5 mg /mL 的 X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸），0.1% 的 Triton X-100，0.5 mmol/L 的氰铁酸盐，50 mmol/L 的磷酸缓冲液（pH=7.0），其中 XGluc 需事先溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中再用于染液配制。2）卡诺固定液按无水乙醇∶冰醋酸=3∶1 的体积比配制。3）透明液按水合氯醛∶ 无菌水∶甘油=8∶3∶1 的体积比配制。

3.3 野生型拟南芥幼苗根尖向重力生长观察

将 16 h 光照/8 h 黑暗条件下生长 3 d 的拟南芥幼苗进行遮光处理（避免向光性干扰），继续垂直培养 1 d 后，将培养皿旋转 90°进行改变重力方向处理。分别在重力方向改变 0、12 和 24 h 后用体视显微镜进

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