PCR定点突变技术是最常用的基因定点突变技术，通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。PCR定点突变技术具有突变回收率高、可在任何位点引入突变、材料和试剂容易获得、操作简单等优点，它又可以分为重叠延伸PCR、大引物PCR等。

1.重叠延伸PCR

     重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如下图3-9所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。

典例1.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是（      ）

A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果
B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基
C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右
D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD

（答案见文末）

2.大引物PCR

大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图3-10所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。

典例2.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得,第一轮加诱变引物和侧翼弓|物(使单链DNA延伸出互补链),第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是（   ）

（答案见文末）

（在做这道题时，有部分同学不太理解什么叫第一轮pcr和第二轮pcr，错误的理解为课本PCR过程中 变性—复性—延伸 这样一次循环）

典例3.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行2轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图（同上题图）所示。请分析回答下列问题：

（1）引物结合到互补DNA链时的温度称退火温度，常规PCR设定的退火温度通常是____。为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮____，第二轮PCR仍需加入的引物是____。

（2） PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，该定点诱变产物需具备____等结构才能进行转录和翻译。新发现UGA（终止密码子）可以对应一种新的氨基酸，下图是已转录出的mRNA部分碱基序列，预测虚线框后的第一个密码子最多有____种。

（3）欲将某功能蛋白的第17位Cys（UGU）改造成Ser（UCU），应将诱变引物设计包含____序列，该过程属于____技术范畴。

参考答案：典例1:D      典例2：C

典例3：55-60℃   高  (另一种)健翼引物启动子和终止子  14  - AGA-或-TCT-  蛋白质工程